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2024-10-25 - 来源：中科检测
引言
流感，作为一种高度传染性的呼吸道疾病，对全球公共卫生构成了严重威胁。由于其病毒具有高度的变异性和抗原漂移能力，传统疫苗在面对新型流感病毒时往往力不从心。因此，开发新型抗流感病毒药物显得尤为重要。中科检测开展抗流感病毒药物筛选服务，本文将以流感病毒RNA聚合酶(RdRP)为靶点，详细介绍抗流感病毒药物的筛选方法。
一、研究背景与目的
流感病毒属于多节段单股负链RNA病毒，其编码的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)与宿主编码的DNA依赖的RNA聚合酶不同，这为开发针对流感病毒的特异性药物提供了可能。研究旨在建立以流感病毒RdRP为靶点的抗流感病毒药物筛选模型，从而发展出新型抗流感药物，这些新药不易随病毒株变异而改变，同时对人体RNA聚合酶无影响。
二、抗流感药物筛选模型的建立
1. 重组质粒的构建：
首先，将萤火虫荧光素酶luc基因编码序列的反向互补序列两端引入流感病毒H1N1(A/WSN/33)M节段的非编码区(5' UTR和3' UTR)。
然后，将这段人工构建的序列插入到pHH21载体的Ⅰ型RNA聚合酶启动子/终止子区，构建重组质粒pFlu-luc。
将重组质粒转化大肠杆菌感受态DH5α，挑选阳性克隆经PCR初步鉴定后，进行测序。
2. 细胞模型的验证：
将表达流感病毒RdRP的四个质粒(pHW181-PB2、pHW182-PB1、pHW183-PA、pHW185-NP)与pFlu-luc共转染293T细胞。
转染后48小时收集细胞，进行荧光信号检测和Western Blotting分析，验证构建的pFlu-luc质粒是否由流感病毒RdRP特异启动。
3. 优化实验条件：
对细胞模型中的五个质粒进行浓度梯度转染，确定各质粒转染量对荧光信号的影响。
通过不同时间点收集细胞并检测荧光信号强度，确定荧光素酶表达量达到最大的时间，即细胞收集和荧光素酶活性测定的最适时间。
三、抗流感药物筛选与评价
1. 验证模型特异性：
选用四种已知作用靶点的抗流感药物(利巴韦林、盐酸金刚烷胺、磷酸奥司他韦和扎那米韦)作用于该模型。
首先用CCK-8法检测细胞毒性，确定药物的CC50值。
进一步检测药物对甲型流感病毒(H1N1/WSN/33)的敏感性，确定药物的IC90值。
2. 药物筛选：
按照药物IC90值选取用量，分别加入抗流感药物作用于该模型，判断药物对流感RdRP活性的影响，评价模型的特异性。
3. 模型稳定性评价：
通过转染两组细胞(共转染五质粒的阳性对照组和只转染质粒pFlu-luc的阴性对照组)进行稳定性评价。
计算Z'因子，评估模型的稳定性和可靠性。
四、结果与讨论
实验结果显示，成功构建了基于流感病毒RdRP的荧光素酶报告系统，并验证了其特异性。通过优化实验条件，确定了最佳的质粒转染量和细胞收集时间。在药物筛选阶段，四种抗流感药物均表现出对流感RdRP活性的抑制作用，验证了模型的特异性。此外，模型稳定性评价结果良好，为后续的药物筛选工作提供了可靠的基础。
五、结论与展望
本文成功建立了以流感病毒RNA聚合酶为靶点的抗流感病毒药物筛选模型，并进行了初步评价。该模型具有特异性高、稳定性好等优点，为开发新型抗流感病毒药物提供了有力工具。未来，将进一步优化筛选条件，扩大药物筛选范围，以期发现更多具有临床应用价值的抗流感病毒药物。
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